試劑盒：顯色和比色分析

　　在試劑盒實(shí)驗中各種酶標儀性能都會(huì )有所不同，所以在使用中應詳細閱讀說(shuō)明書(shū)，再進(jìn)行下一步操作。

　　自從20世紀60-70年代問(wèn)世以來(lái)，Elisa法得到*科研工作者的認可及推崇，在歐美及中國獲得很大的推廣，尤其是國內生化領(lǐng)域的長(cháng)足發(fā)展。試劑盒有著(zhù)準確性高、靈敏度高、特異性強等很多的優(yōu)點(diǎn)，它在檢測抗體、抗原等方面有很好的應用，深受廣大用戶(hù)朋友的喜愛(ài)。然而，在實(shí)驗過(guò)程中，也需要注意很多問(wèn)題，特別是顯色、比色問(wèn)題。

　　顯色

　　顯色是ELISA中的一步溫育反應，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴格控制，有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯色適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間，及時(shí)判斷。

　　OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長(cháng)反應時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色，顯色反應應避光進(jìn)行，顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

　　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性，宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，2小時(shí)后即可*消退無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)（450nm）測讀吸光值。

　　比色

　　比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著(zhù)的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。

　　比色時(shí)應先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。