細胞凋亡檢測技術(shù)與方法

 細胞凋亡（Apoptosis），又稱(chēng)細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。細胞凋亡概念提出今還不到30年的時(shí)間，但由于它在保證多細胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著(zhù)關(guān)鍵角色，對個(gè)體的正常發(fā)育及細胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界熱門(mén)話(huà)題之一，也是生命科學(xué)界乃社會(huì )各界爭相投入的研究領(lǐng)域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導方面的文章遠遠超過(guò)位于第二位的人類(lèi)基因組方面的，而信號傳導中一個(gè)重要的前沿領(lǐng)域就是細胞凋亡的研究。隨著(zhù)這方面研究的持續升溫，涌現出了大量新的技術(shù)和方法對細胞凋亡進(jìn)行檢測，其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現，大大加速了研究的進(jìn)程。具體來(lái)說(shuō)，針對凋亡的不同階段有以下一些方法：

       1． 早期檢測:

        1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

        PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個(gè)鈣依賴(lài)性的磷脂結合蛋白，能專(zhuān)一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來(lái)標記凋亡的發(fā)展階段。

        BioVision公司位于美國加州，是世界上專(zhuān)著(zhù)于凋亡和細胞信號研究的公司。其產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉、包裝使用方便。BioVision提供多種標記的Annexin V產(chǎn)品，并有與核染料PI組成完整早期凋亡檢測試劑盒。

        BMS（Bender Medsystems）公司擁有Annexin V專(zhuān)li權，可提供各種規格的Annexin V凋亡檢測試劑盒。其中Annexin V FITC試劑盒中包含Annexin V和核染料PI，且具小包裝，適合檢測小樣本的客戶(hù)。

       另外，Biovision公司和德國美天妮公司提供磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

        2）細胞內氧化還原狀態(tài)改變的檢測：

       正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過(guò)被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線(xiàn)粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類(lèi)型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動(dòng)的ATP依賴(lài)的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非?；钴S時(shí)，細胞液就由還原環(huán)境轉為氧化環(huán)境，這可能導致了凋亡早期細胞線(xiàn)粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線(xiàn)粒體內轉移到細胞液中，啟動(dòng)凋亡效應器caspase的級聯(lián)反應。

       由于 GSH與氧化還原作用及線(xiàn)粒體功能密切相關(guān)，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時(shí)沒(méi)有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。

       3）細胞色素C的定位檢測

       細胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中發(fā)揮著(zhù)重要的作用。正常情況下，它存在于線(xiàn)粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線(xiàn)粒體釋放細胞液，結合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

       細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線(xiàn)粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時(shí)，它保留在線(xiàn)粒體內，因而它是線(xiàn)粒體富集部分的一個(gè)非常有用的標志。Cytochrome c Apoptosis Assay Kit試劑盒可以有效地檢測凋亡過(guò)程中細胞色素c的釋放情況。

       4) 線(xiàn)粒體膜電位變化的檢測：

       在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀(guān)測上線(xiàn)粒體沒(méi)有明顯的變化。隨著(zhù)凋亡機制研究的深入，發(fā)現線(xiàn)粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線(xiàn)粒體轉膜電位會(huì )發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個(gè)陽(yáng)離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線(xiàn)粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線(xiàn)粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。Biovision公司的MitoCaptureTM Mitochondrial Apoptosis Detection Kit（MitoCaptureTM線(xiàn)粒體凋亡檢測試劑盒）可以簡(jiǎn)單、靈敏地體外分析、檢測線(xiàn)粒體在凋亡過(guò)程中的變化。

        2． 晚期檢測：
 

      細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長(cháng)度在180-200 bp 的片段。

        1） 凋亡 DNA Ladder 檢測試劑盒

       細胞經(jīng)處理后，采用常規方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀(guān)察到典型的DNA ladder。Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit可以快速（約1-2小時(shí)）、靈敏地檢測凋亡細胞中的片段。

       2） TUNEL-based DNA 分析試劑盒

       細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測。Apo-BrdUTM分析使用2種顏色的TUNEL方法用流式細胞儀檢測凋亡細胞中DNA條帶。采用的BrdU比生物素標記的或地gao辛（digoxigenylated）標記的方法靈敏度更高。新增的ApoBrdU-IHCTM是一種完整的試劑盒用于雙色的免疫組化（IHC）檢測片段。Apo-DIRECTTM是非常簡(jiǎn)單的一步標記凋亡細胞，用于流式細胞術(shù)分析。

       3）Caspase分析試劑和試劑盒

        Caspase在細胞凋亡中發(fā)揮著(zhù)重要的作用，屬于天冬氨酸蛋白酶。其中caspase-3為關(guān)鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。在正常狀態(tài)下，caspase家族都以無(wú)活性的酶原(30～50kD)形式表達，Caspase酶原由原結構域、大亞基（～20kD ）和小亞基(～10kD )構成。當細胞發(fā)生凋亡時(shí)caspase可以被蛋白酶裂解，大亞基和小亞基形成活化的caspase。一些caspase活化后可以次序激活其他caspase形成caspase級聯(lián)反應，促發(fā)細胞凋亡。

       Biovision公司作為世界ling先的細胞凋亡試劑研發(fā)和供應商，可以提供全面的、高質(zhì)量的caspase相關(guān)檢測試劑。