細胞凍存與復蘇

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，利用凍存技術(shù)將細胞冷凍保存在-196℃液氮中，可以使細胞暫時(shí)停止生長(cháng)并保留細胞特性，以便在需要時(shí)再復蘇細胞用于實(shí)驗。同時(shí)保存適量的細胞，可以防止細胞在培養過(guò)程中因受到污染或其他意外事件導致細胞丟種，起到細胞保種的作用。

細胞凍存和復蘇采取“慢凍快融"的原則，慢速冷凍可使細胞內的水份滲出細胞外，減少細胞內形成冰晶的機會(huì )；快融以保證細胞外結晶快速融化，避免慢速融化水份滲入細胞內，再次形成胞內冰晶造成對細胞的損傷。

細胞凍存時(shí)需向培養基中加入冷凍保護劑，可保護細胞在冷凍時(shí)免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑可根據其是否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性?xún)深?lèi)：

1.滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

2.非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥YI基淀粉等。

（一）細胞凍存一般步驟

1. 準備已滅菌的凍存培養液，并4℃預冷；

2. 選取對數生長(cháng)期的細胞，棄掉細胞培養液，用細胞消化酶（如胰蛋白酶）進(jìn)行消化，適時(shí)去掉消化液，加入少量新鮮培養液。懸浮生長(cháng)的細胞不進(jìn)行消化處理，直接將細胞收集于離心管中離心，1000 rpm，5-10 min；

3. 棄去上清液，逐漸加入適量預冷的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節細胞濃度在5×10⁶～1×10⁷/mL之間；

4. 將上述細胞分裝于2 mL凍存管中，每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱(chēng)、凍存日期和操作者；

5. 凍存：標準的降溫速率開(kāi)始為-1～-2℃/ min，當溫度降到-80℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-80℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

（二）細胞復蘇一般步驟

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)使其盡快融化；

2. 從37℃水浴中取出凍存管，在無(wú)菌條件下取出細胞，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻，以1000 rpm，5-10 min離心；

4. 棄去上清液，加入適量培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度后接種到培養瓶中，37℃培養箱靜置培養；

5. 次日更換一次培養液，繼續培養。

（三）注意事項

1. 配制好的細胞凍存液要進(jìn)行預冷，新鮮配制的凍存液會(huì )產(chǎn)生大量的熱。

2. 凍存的細胞在半年后，建議取出一只凍存管細胞復蘇培養，觀(guān)察生長(cháng)情況，然后再繼續凍存。