非小細胞肺癌具有JI端的免疫多樣性！

在惡性腫瘤中，肺癌在全球發(fā)病率和死亡率位居前列，特別是非小細胞肺癌（NSCLC），占比高，且存在高度侵襲性、異質(zhì)性，而且組織學(xué)亞型復雜和突變特征明顯。

腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性在單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)的進(jìn)步下，也逐漸被解剖。但是單細胞RNA測序（scRNA-seq）存在樣本量有限，缺乏基因組數據和長(cháng)期隨訪(fǎng)數據，因此在分析腫瘤微環(huán)境生物的異質(zhì)性、藥物耐藥性等方面較為片面。

在NSCLC腫瘤微環(huán)境中，白細胞是重要的細胞類(lèi)型，根據往期實(shí)驗數據得出：中性粒細胞在瘤內駐留白細胞中占比8%-20%。但是，單細胞RNA測序（scRNA-seq）在中性粒細胞方面的研究較少，因此，加強NSCLC 腫瘤微環(huán)境中中性粒細胞的研究，意義重大。

最近，奧地利因斯布魯克醫科大學(xué)的Zlatko Trajanoski和Andreas Pircher研究團隊在Cancer Cell發(fā)表題為《High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer》的論文，研究發(fā)現：中性粒細胞（TRNs）亞群在NSCLC的腫瘤微環(huán)境中具有不同的功能特性，尤其是，TRNs的基因標記與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的不良預后相關(guān)。

論文首頁(yè)截圖

該研究團隊根據公開(kāi)的scRNA-seq數據集，對比自己團隊的NSCLC數據集（UKIM-V），根據大數據，進(jìn)行全面的分析，整合出一個(gè)全新的NSCLC單細胞核心圖譜。在該圖譜中，轉錄組數據為298名(212名NSCLC患者,86名對照者),腫瘤樣本數據為364個(gè)（196個(gè)腫瘤樣本，168個(gè)非腫瘤）。在212名NSCLC患者中，肺腺癌（LUAD）為156人，占比73.6%；肺鱗狀細胞癌（LUSC）為41人，占比19.3%。

根據NSCLC核心圖譜的研究結果跟流式細胞分析數據一致,說(shuō)明：中性粒細胞群僅占所有細胞的1.5%，但是圖譜里78%的中性粒細胞來(lái)自UKIM-V數據集，其中中性粒細胞分別占UKIM-V所有細胞的12%和所有白細胞的18%。中性粒細胞表達的mRNA分子量極低，發(fā)現是由于其半衰期較短，僅為7-10小時(shí)。對比多種測序結果發(fā)現，BD Rhapsody平臺捕獲的mRNA分子數量要豐富得多，因此可能更適合檢測低mRNA含量的細胞。

結合上述結果，該研究團隊利用BD Rhapsody平臺測序的UKIM-V隊列數據和中性粒細胞的轉錄組特征進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現：LUSC中中性粒細胞比例明顯較高，而LUAD中巨噬細胞、CD4 T細胞、2型肺泡細胞、過(guò)渡型棒狀細胞/2型肺泡細胞（transitional club/AT2）更為豐富。

研究的總體流程和細胞類(lèi)型

 根據患者腫瘤微環(huán)境浸潤模式，該研究團隊將NSCLC患者分為了四個(gè)類(lèi)別：免疫荒漠型、B細胞優(yōu)勢型、髓系細胞優(yōu)勢型、T細胞優(yōu)勢型。其中，免疫荒漠型沒(méi)有明顯的免疫細胞浸潤，但腫瘤細胞比例高；B細胞優(yōu)勢型主要為B細胞、漿細胞和肥大細胞；髓系細胞優(yōu)勢型主要為巨噬細胞和單核細胞；T細胞優(yōu)勢型主要為CD8 T細胞、CD4 T細胞和調節性T細胞。不同免疫表型也表現出具有差異性的細胞因子信號特征。

不同腫瘤免疫表型的細胞因子信號特征

 根據早期的研究結果發(fā)現，LUAD以炎癥狀態(tài)為主，LUSC傷口愈合狀態(tài)為主。根據細胞-細胞通信網(wǎng)絡(luò )的差異，該研究團隊進(jìn)一步實(shí)驗發(fā)現：LUAD以KDR（VEGFR2，血管內皮細胞生長(cháng)因子受體2）-VEGFA（血管內皮生長(cháng)因子A）通信上調為特征，通過(guò)促進(jìn)血管生成，開(kāi)啟免疫抑制信號，而LUSC則以SPP1（分泌型磷蛋白1）和JAG-NOTCH信號通路上調為主要特征，前者促進(jìn)腫瘤轉移，后者通過(guò)募集中性粒細胞調節腫瘤免疫微環(huán)境。

細胞互作分析

 根據TCGA隊列數據的分析，發(fā)現轉錄組與生存數據之間的關(guān)系：腫瘤B細胞的富集度與NSCLC患者的良好預后成正相關(guān)，而中性粒細胞則呈負相關(guān)；而CD8 T細胞亞型的分析顯示，幼稚CD8 T細胞與良好預后呈正相關(guān)。

TCGA數據中細胞組成和生存率的關(guān)系

  根據對NSCLC中TRNs的異質(zhì)性細胞亞群的鑒定發(fā)現：腫瘤相關(guān)中性粒細胞（TANs）和鄰近正常組織相關(guān)中性粒細胞（NANs）的表達譜特征不同，且中性粒細胞是腫瘤微環(huán)境中VEGFA的主要來(lái)源，印證了TRNs重要的促血管生成作用。

同時(shí)該研究團隊還發(fā)現：TANs中凝集素型氧化低密度脂蛋白受體1（LOX-1）表達升高，腫瘤組織中存在較多的LOX-1+細胞浸潤，但在匹配的相鄰的正常肺組織中未發(fā)現LOX-1+細胞浸潤，說(shuō)明LOX-1可能是一種特異性的TANs標記物。

為了深入解析TRNs不同亞群的異質(zhì)性，研究團隊繼續對圖譜中TRNs進(jìn)行聚類(lèi)分析，鑒定出了4個(gè)TAN亞群和3個(gè)NAN亞群。

值得注意的是，TAN-2亞群CD274（PD-L1）/PDCD1（PD-1）信號通路顯著(zhù)上調，提示了TAN對CD8 T細胞的免疫抑制作用，這與過(guò)去報道的中性粒細胞的富集與抗PD-1/PD-L1治療無(wú)應答有關(guān)的結果一致。

為了確定TRNs在NSCLC患者中的預后價(jià)值，研究團隊分析NSCLC患者治療前腫瘤的RNA-seq數據，這些患者經(jīng)歷了抗PD-L1抗體或化療藥單藥治療。結果顯示，TRN基因標記與抗PD-L1治療應答和生存預后呈明顯負相關(guān)（p=0.003），但在化療組中并不顯著(zhù)。

TRN基因標記與免疫治療應答和預后的關(guān)

  綜上所述，這個(gè)研究從單細胞層面全面剖析了NSCLC腫瘤微環(huán)境，一方面，分析了中性粒細胞群對腫瘤微環(huán)境中具有不同功能特性的TRNs亞群進(jìn)行深入表征，另外一方面，彌補了基因組數據以及長(cháng)期隨訪(fǎng)數據，揭示了中性粒細胞與免疫治療抵抗和不良生存結局的關(guān)聯(lián)，為后續開(kāi)發(fā)中性粒細胞耗竭劑奠定了基礎。

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