細胞轉染常見(jiàn)方法之原理、特點(diǎn)及實(shí)驗步驟

隨著(zhù)分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，細胞轉染已經(jīng)成為研究真核細胞基因功能的常規工具。常用于研究基因功能、基因表達調控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應用非常廣泛。

目前實(shí)驗室最為常用的細胞轉染方法有兩種：脂質(zhì)體轉染法和電穿孔法，接下去分別介紹這兩種方法的原理、特點(diǎn)和實(shí)驗步驟。

一、脂質(zhì)體轉染法

1. 原理

陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過(guò)靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA-脂質(zhì)體復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過(guò)融合或細胞內吞進(jìn)入細胞（見(jiàn)下圖）。脂質(zhì)體轉染適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實(shí)驗室最fang便的轉染方法之一，其轉染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細胞有一定的毒性，所以轉染時(shí)間一般不超過(guò)24小時(shí)。

2. 特點(diǎn)

脂質(zhì)體轉染法的優(yōu)點(diǎn)是能夠高效轉染許多細胞系，適用于高通量篩選，并能夠遞送任何大小的 DNA 以及 RNA 和蛋白。此外，該方法既可應用于穩定表達，也可應用于瞬時(shí)表達，與其他化學(xué)方法不同的是，其可用于將 DNA 和 RNA 向動(dòng)物和人體內轉移；缺點(diǎn)是轉染效率依賴(lài)于細胞類(lèi)型和培養條件，因此，需要對每種細胞類(lèi)型的轉染條件和轉染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

3. 實(shí)驗步驟

將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經(jīng)細胞內吞作用進(jìn)入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

二、電穿孔法

1. 原理

利用電脈沖可逆地擊穿細胞膜形成瞬時(shí)的膜上小孔，同時(shí)細胞膜上電勢升高，驅使帶電荷的分子（如 DNA）以類(lèi)似于電泳的方式經(jīng)臨時(shí)微孔穿過(guò)細胞膜進(jìn)入胞內（見(jiàn)下圖）。當遇到某些脂質(zhì)體轉染效率很低或幾乎無(wú)法轉入時(shí)建議用電穿孔法轉染。一般情況下，高電場(chǎng)強度會(huì )殺死50%-70% 的細胞。為確保轉染成功，針對實(shí)驗條件優(yōu)化電轉參數是極為重要的。電場(chǎng)強度、脈沖形狀、脈沖施加次數、緩沖液組分等因素都會(huì )影響轉染效率。

2. 特點(diǎn)

與其他轉染方法相比，電轉染具有諸多優(yōu)勢，其中主要優(yōu)勢包括：適用于所有細胞類(lèi)型的瞬時(shí)和穩定轉染；在確定最佳電轉染條件的情況下，能夠在短時(shí)間內轉染大量細胞。電轉的主要缺點(diǎn)在于高電壓脈沖可引起大量細胞死亡，僅部分細胞膜可以成功修復，因此相比化學(xué)轉染方法，電轉染需要使用更多數量的細胞。

3. 實(shí)驗步驟

利用電轉緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導產(chǎn)生暫時(shí)的孔使核酸進(jìn)入細胞→將細胞返回到生長(cháng)培養基中，使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。

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