qPCR曲線(xiàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？如何解決？

在 qPCR 實(shí)驗過(guò)程中，經(jīng)常會(huì )遇到異常擴增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)的困擾，那么qPCR曲線(xiàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些呢？該如何解決呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、擴增曲線(xiàn)相關(guān)問(wèn)題

1.無(wú)擴增曲線(xiàn)

可能原因：

（1）沒(méi)有打開(kāi)熒光信號采集。檢查程序設置，三步法擴增程序在 72℃ 延伸階段采集信號，兩步法擴增程序的信號采集設置在退火延伸步驟。

（2）引物降解?？赏ㄟ^(guò) PAGE 電泳檢驗引物的完整性。

（3）模板濃度低。建議增加模板投入量或重新制備較高濃度模板。

2. 擴增曲線(xiàn)不光滑

可能原因：

（1）儀器長(cháng)時(shí)間未校準，在檢測中出現了波動(dòng)，建議定期校準儀器；

（2）RNA 模板不純，建議增大模板稀釋倍數或者重新制備較高純度的 RNA 模板。

3. 擴增曲線(xiàn)平臺期抖動(dòng)

可能原因：儀器與管材不匹配導致的信號采集產(chǎn)生波動(dòng)。

4. 擴增曲線(xiàn)右下方下落呈倒扣狀

可能的原因：模板濃度過(guò)高，基線(xiàn)終點(diǎn)值大于 CT 值，儀器默認起峰位置仍為基線(xiàn)期，將起峰位置往基線(xiàn)下拉，所以擴增曲線(xiàn)變成了倒扣的 S 形（左圖）?？蛇m當減小基線(xiàn)范圍，手動(dòng)調整基線(xiàn)終點(diǎn)值至 CT 值 -4，調整基線(xiàn)范圍后，擴增曲線(xiàn)即恢復正常（右圖）。

二、熔解曲線(xiàn)相關(guān)問(wèn)題

1. 有擴增曲線(xiàn)無(wú)溶解曲線(xiàn)

可能原因：檢查是否有設置熔解曲線(xiàn)步驟或熔解曲線(xiàn)信號采集是否打開(kāi)。

2. 熔解曲線(xiàn)雜峰

（1）雜峰在主峰之前

可能的原因：雜峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范圍內，一般是引物二聚體。引物二聚體是引物 3’ 端的部分堿基互補結合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的雙鏈 DNA 片段?？筛鶕?NTC（無(wú)模板陰性對照）判斷是否為引物二聚體。

解決方案：建議通過(guò)提高模板濃度、提高退火溫度、降低引物濃度來(lái)改善。

（2）雜峰在主峰之后

可能的原因：非特異性擴增，可能由于引物特異性較差，或體系中有氣溶膠污染（可結合 NTC 確定體系是否有污染）。建議先提高退火溫度，可提高擴增特異性。如果提高退火溫度對于特異性沒(méi)有改善，建議更換特異性較高的引物。

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