流式細胞周期檢測的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？

你知道流式細胞周期檢測的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、樣本制備注意事項

1.根據不同的檢測細胞調整合適的溫度、濕度、酸堿度等培養環(huán)境，注意一定要無(wú)菌的環(huán)境培養。

2.培養細胞時(shí)，以對數期處理為宜，避免細胞量過(guò)少導致收集細胞量不足或者細胞量過(guò)多導致細胞開(kāi)始大量死亡造成的實(shí)驗誤差。

3.流式檢測細胞周期上機檢測所需收集細胞量較多，收集細胞時(shí)盡量多收集一些

4.流式檢測對細胞離心，重懸次數較多，注意動(dòng)作輕緩，避免過(guò)多地損傷、弄破細胞。

5.本實(shí)驗對細胞離心，重懸次數較多，注意動(dòng)作輕緩，避免過(guò)多地損傷細胞。

6.細胞周期待測細胞盡量要獲得單個(gè)細胞，避免DNA的降解。

7.樣本最關(guān)鍵的就是減少碎片(EDTA/不可過(guò)度吹打/離心rpm)。PI既能與DNA結合，又能與RNA結合，所以要用RNase降解。PI質(zhì)量及RNase所加量很重要，建議用商品化試劑。

8.污染脫氧核糖核酸酶會(huì )降解DNA，故玻璃器皿和試劑要干凈滅菌。

9.染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護。

二、流式檢測時(shí)的注意事項

1.固定時(shí)必須預冷PBS重懸打入無(wú)水乙醇中，做到隨加隨混勻，避免細胞形成團塊。

2.固定后細胞雖然可以保存較長(cháng)時(shí)間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好盡早上機檢測。

3.進(jìn)樣速度：一般檢測細胞濃度調整為2*10^5到2*10^6/ml，建議進(jìn)樣速度為低速。若峰形較寬、CV較大，可能就是進(jìn)樣速度太快。

4.儀器質(zhì)控定期做，檢查質(zhì)控微球的CV值，盡可能排除因機器設置引起的峰形加寬。

5.通過(guò)電壓脈沖信號的寬度、高度、面積等參數區別實(shí)體組織標本中的粘連細胞群體，zui大程度的減少粘連細胞帶來(lái)的假陽(yáng)性結果。

6.選擇合適的細胞系，不同的細胞系由于細胞形態(tài)、直徑等不同，會(huì )對結果的美觀(guān)程度有一定的影響，筆者常用HeLa細胞系，峰形較細，周期各階段明顯區別，結果美觀(guān)。

7.建議選擇6孔板操作，細胞給藥密度在40%左右，給藥時(shí)間不一定要與蛋白印跡法給藥時(shí)間一致。這是由于蛋白印跡法檢測的是蛋白表達的變化，例如給藥10小時(shí)，蛋白上可見(jiàn)明顯變化趨勢，但10小時(shí)收樣時(shí)，孔內細胞已經(jīng)明顯觀(guān)察到細胞漂浮凋亡，那對流式檢測的結果會(huì )有很大的影響。流式細胞術(shù)收樣時(shí)，盡量保證孔內細胞還未漂浮。

8.收樣時(shí)，如果孔內已經(jīng)有細胞漂浮，細胞上清懸浮液也要收集。建議選用胰酶消化，消化時(shí)間必須嚴格控制，及時(shí)終止消化，消化時(shí)間太久，容易對細胞造成損傷和死亡。

9.收集細胞時(shí)，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，小心吸去上清。加入0.3 mL預冷的PBS，將管內的細胞混勻后，再加入0.7 mL預冷的無(wú)水乙醇，4℃固定過(guò)夜。整個(gè)收樣過(guò)程中，不要用槍頭劇烈吹打細胞，一是會(huì )損傷細胞，二是造成細胞損失。

10.上機前，離心機選用4℃，300-500g離心5分鐘，棄去上清。此時(shí)格外需要注意的是由于不同時(shí)期細胞的重量不一樣，離心后細胞不是全部沉淀在管底，管壁上也會(huì )存在大量細胞，去上清一定要注意。加入100 μg/mL的PI染色液，避光染色15分鐘以上，上機測試前最好使用200目篩網(wǎng)過(guò)篩，以免細胞聚集堵塞機器管道。

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