知道懸浮細胞的瞬時(shí)轉染操作有什么嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
一、細胞轉染前的準備
1、細胞:
貼壁生長(cháng)細胞:一般要求在轉染前一日,必須應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養皿或瓶,轉染當日的細胞密度以70-90%(貼壁細胞),最好在轉染前2-4 h換一次新鮮培養液。
懸浮細胞:轉染前12-16 h進(jìn)行懸浮細胞傳代,傳代后適宜的細胞密度為20-40×104/mL。臺盼藍染色進(jìn)行活細胞計數保持活細胞比在95%以上。
提前將293F細胞的密度調整至合適的密度后(2×106-4×106細胞/ml)于37℃搖床培養2-4 h后進(jìn)行轉染。注意,參與轉染的細胞必須是培養三代或以上的穩定細胞株。
2、DNA:
使用去內毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒,于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過(guò)濾除菌。
3、稀釋液:
于生物安全柜/超凈臺用0.22μm濾頭過(guò)濾除菌。
4、轉染試劑:
轉染試劑如PEI溶液長(cháng)期儲存于-20℃,不可反復凍融,溶液在4℃放置不超過(guò)一周。
二、操作步驟(懸浮細胞)
1、取一支已滅菌的Ep管,加入一定量的DNA,以相應體積的300 mM NaCl稀釋?zhuān)脴岊^混勻后靜置5 min;
另取一支已滅菌的Ep管,加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min(稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉染體積的5%)。
將質(zhì)粒和PEI溶液混合,槍頭混勻后靜置一段時(shí)間,使DNA與PEI形成穩定的聚合物。
2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉染混合液,邊加邊搖晃搖瓶使轉染更加充分。
3、轉染后將懸浮細胞置于搖床中培養,條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細胞計數并用臺盼藍染色液觀(guān)察細胞的存活率。
更多有關(guān)懸浮細胞的瞬時(shí)轉染操作,請聯(lián)系北京百奧創(chuàng )新科技有限公司。