慢病毒包裝

慢病毒(Lentivirus) 載體是以HIV-1 (人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒)為基礎發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。所以，在體外實(shí)驗及體內實(shí)驗的研究中，慢病毒己經(jīng)成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一， 并且正在獲得越來(lái)越廣泛的應用。

      在細胞實(shí)驗中，對于按常規方法難以轉染甚無(wú)法轉染的細胞，通過(guò)使用病毒介導的方式能夠大大提高基因的轉導效率，達到目的基因高效表達的目的。

       具體來(lái)說(shuō)，慢病毒包裝主要應用于以下幾個(gè)方面：

       1、對于難轉染的細胞，如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等，能大大提高目的基因轉導效率，而且目的基因整合到宿主細胞基因組的幾率大大增加，極大地方便了RNAi，cDNA克隆以及報告基因的研究；

       2、進(jìn)行穩轉細胞株的篩選；

       3、為活體動(dòng)物模型實(shí)驗提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液；

       為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，通常需要利用慢病毒表達載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉染細胞，在細胞中進(jìn)行病毒的包裝。慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息，慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D錄、包裝、重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中。離心收集上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細胞后，在細胞漿中被其自身攜帶的逆轉錄酶逆轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進(jìn)入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白或產(chǎn)生RNAi干擾。

       慢病毒包裝實(shí)驗方法

        1.構建含有目的基因的慢病毒表達載體

        2.細胞準備：細胞傳代后，密度達到70％左右時(shí)進(jìn)行轉染；

        3.轉染復合物制備：取兩個(gè)EP管，一個(gè)（A管）加入慢病毒載體的表達質(zhì)粒、混合包裝質(zhì)粒和Opti-MEMI；另一個(gè)（B管）加入Opti-MEMI、轉染試劑，一邊輕柔渦旋A管，一邊往A管滴加B管的溶液。溶液混合后，室溫放置10-25分鐘，即完成轉染復合物的制備。

        4.細胞轉染：將混合液逐滴加入細胞培養皿中，混勻后孵育；

        5.收集病毒：轉染后48h、72h收集含慢病毒的上清；