細胞轉染：瞬時(shí)轉染和穩定轉染及轉染效率影響因素

真核蛋白表達細胞轉染方式有兩種：瞬時(shí)轉染和穩定轉染，本文的主要介紹了兩者的定義和適用性及細胞轉染一般步驟，影響轉染效率的因素，幫助我們提高實(shí)驗的成功率。

在哺乳動(dòng)物細胞蛋白表達實(shí)驗，根據不同的實(shí)驗目的，將質(zhì)粒導入細胞有兩種方法：瞬時(shí)轉染和穩定轉染。細胞轉染是將外源基因導入真核細胞的過(guò)程。質(zhì)粒、DNA、RNA將這些外源基因導入到真核細胞內并不容易，要跨越細胞膜的屏障進(jìn)入細胞質(zhì)。

瞬時(shí)轉染

瞬時(shí)轉染是指外源基因導入到細胞后得以表達，但是基因不整合到細胞的基因組上，因此不會(huì )隨著(zhù)細胞的生長(cháng)復制。因此，瞬時(shí)轉染的時(shí)間有限，通常只持續幾天，直到外源基因在細胞生長(cháng)分裂過(guò)程中因各種因素消失為止。判斷細胞是否轉染成功，在構建質(zhì)粒上含有報告基團，以指示目標基因是否存在，一般在轉染兩天后即能被檢測到。

穩定轉染

穩定轉染是在瞬時(shí)轉染的基礎上，瞬時(shí)轉染時(shí)有一小部分的基因會(huì )整合到細胞基因組上，并隨著(zhù)細胞的生長(cháng)分裂，質(zhì)粒會(huì )隨機分配到子細胞中從而稀釋直終丟失，所以穩定轉染要進(jìn)行穩定細胞系的篩選，經(jīng)過(guò)篩選出來(lái)的細胞株，此時(shí)的質(zhì)粒已經(jīng)*整合到細胞基因組中，隨著(zhù)細胞的生長(cháng)復制并穩定的遺傳給后代。

瞬轉穩轉適用性

瞬時(shí)轉染表達和穩定轉染表達顯著(zhù)的區別就是在時(shí)間上。瞬時(shí)轉染在轉染后四天即能收獲細胞，瞬時(shí)轉染一般用于基因產(chǎn)物的短期表達、基因敲除、蛋白質(zhì)的小規模合成。相對于瞬時(shí)轉染，穩定轉染表達適用于長(cháng)期的藥理學(xué)研究遺傳調控機制研究及大規模的蛋白質(zhì)合成，需要大量的周期，因此更費力成本投入高。目前，在進(jìn)行哺乳動(dòng)物細胞蛋白表達蛋白時(shí)，因為細胞培養技術(shù)的進(jìn)步和人們對瞬時(shí)轉染的不斷探索，人們已經(jīng)可以對一些常用細胞進(jìn)行懸浮培養，實(shí)現了瞬時(shí)轉染對重組蛋白的大規模合成，節省了時(shí)間和成本。

細胞轉染一般步驟

以24孔板進(jìn)行細胞瞬時(shí)轉染表達為例，全程操作均為無(wú)菌狀態(tài)，以免造成細胞污染

1）轉染前準備，細胞株或者直接培養后的細胞用胰蛋白酶消化后計數，鋪板，培養基為含有1ml血清，不含抗性的正常培養基。

2）針對每孔細胞，用50-100ul無(wú)血清培養基稀釋0.8-1.6ug的質(zhì)粒，并混勻

3）針對每孔細胞，用50-100ul無(wú)血清培養基稀釋4ul左右的轉染試劑，混勻室溫防止5min

4）將第二第三步的溶液混勻室溫防止20-30min

5）用PBS沖洗細胞，在用無(wú)血清培養基沖洗細胞，在加入0.5ml的無(wú)血清培養基

6）將四步驟得到的混合物加入到每孔中，輕搖混勻后放入37℃，5%的二氧化碳培養箱中培養5-6h

7）將無(wú)血清培養基換為血清培養基（10%胎牛血清）孵育24-96h后檢測結果。穩定表達，在轉染24h后傳代新鮮培養液中，48h后加入抗性，穩定表達需要數周時(shí)間。

哺乳動(dòng)物細胞瞬時(shí)轉染流程圖

影響轉染效率因素

1. 轉染試劑

瞬時(shí)轉染和穩定轉染可以選擇不同的轉染試劑，轉染試劑的選擇又可以根據已經(jīng)發(fā)表的文獻。已經(jīng)有很多細胞株被成功轉染，通過(guò)文獻資料可以參考適的轉染試劑，當然也要根據不同的實(shí)驗需求選擇。此外，不同的轉染方法也要選擇不同的試劑，一般要求是轉染試劑要低毒，高效，廉價(jià)易得。

2. 轉染方法

轉染方法分為兩類(lèi)：瞬時(shí)轉染和穩定轉染。轉染方法的選擇對轉染結果影響也很大，。根據細胞的性質(zhì)及不同的操作手法，摸索轉染條件。瞬時(shí)轉染和穩定轉染都需要優(yōu)化DNA 與轉染試劑比例， 細胞培養及檢測時(shí)間。一些傳統的轉染技術(shù)，如磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體轉染法都各有利弊，關(guān)于各種轉染方法的比較和原理，可參見(jiàn)細胞培養方法的比較。

3. 細胞狀態(tài)

一般傳代數小于50代以下的細胞即能保證基因型不變。瞬時(shí)轉染合適的細胞是達到對數生長(cháng)期的細胞，此時(shí)細胞生長(cháng)旺盛，容易被轉染。同一種系的細胞株，在不同實(shí)驗室不同培養條件下，其生物學(xué)性狀都會(huì )產(chǎn)生不同改變，從而導致其轉染特性也發(fā)生變化。因此，針對這種轉染效率降低的情況，應轉用新鮮培養的細胞轉染達到好的結果。

4. 載體構建

基因產(chǎn)物對細胞不能有毒害作用，瞬時(shí)轉染難以進(jìn)行。轉染載體的構建選擇可調控，強度合適的啟動(dòng)子很重要，可以做空載體或相同載體的其他基因為對照排除毒性對細胞的影響。 病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞。

5. 其他要求

（1）細胞培養基

培養基是瞬時(shí)轉染的基本要素。不同細胞選擇不同的培養基，血清和其他添加物。使用的轉染試劑要參考其說(shuō)明書(shū)。培養物一定要避免細菌，支原體真菌的污染。

（2）血清

血清是一種包含生長(cháng)因子及其它輔助因子的成分不明確添加物，對不同細胞的生長(cháng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細胞生長(cháng)，因此也會(huì )影響細胞轉染效率，不同批次購買(mǎi)的血清質(zhì)量也會(huì )存在差別。對于傳統的轉染方法要求在無(wú)血清培養基條件下轉染，血清被認為會(huì )降低瞬時(shí)轉染的效率。針對現有人們常用的的轉染試劑來(lái)說(shuō)，血清的存在已不會(huì )影響轉染效率，甚還有助于提高轉染效率。在轉染過(guò)程中*可以使用血清，針對RNA 轉染，消除血清中潛在的核糖核酸酶污染要格外關(guān)注。且血清比較珍貴，胎牛血清，馬或牛血清都常被用到，價(jià)格也不盡相同，根據自身選擇。

（3）細胞密度

細胞密度對轉染效率也有一定影響，一般轉染時(shí)貼壁細胞密度為50-90%，具體要根據選用的轉染試劑的說(shuō)明書(shū)。不同的轉染試劑適的細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì )因不同的細胞類(lèi)型或應用而異。

例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而要更高的細胞鋪板密度或更多的懸浮細胞數， 盡量在細胞適的生理狀態(tài)下轉染，以求好的轉染效果。

（4）DNA 質(zhì)量

針對一般常用的轉染技術(shù)都是基于電荷吸引的原理轉染的，如果DNA的純度不高，存在其他雜質(zhì)，如鹽離子等都會(huì )影響轉染復合物的形成。針對市面上現有的超純質(zhì)粒抽提的試劑盒，能達到非常高的純度效果，從而可以避免DNA純度的影響。