你知道PCR引物設計原則是什么嗎？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要兩種引物。一種與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補， 另—種與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設計。引物設計的好壞，直接影響了PCR的結果。成功的PCR反應既要高效，又要特異性擴增產(chǎn)物。那么PCR引物設計的原則有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

引物設計的目的是在兩個(gè)目標之間取得平衡：擴增特異性和效率。因此，引物的設計需要遵循以下原則

一、引物長(cháng)度要適宜

一般，引物的長(cháng)度為15-23bp，常用的長(cháng)度為18-21bp。過(guò)長(cháng)會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq 酶進(jìn)行反應。過(guò)短則特異性差。

二、引物GC含量要適宜

1.引物3'端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高， 而其它三種堿基的錯誤引發(fā)效率相對小一些。

2.3'端防止連續三個(gè)C或G，引物的GC含量一般為45-55%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應。

3.上下游引物的GC含量不能相差太大。

三、引物自身及引物之間不應存在互補序列

堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個(gè)堿基的互補。否則引物自身會(huì )折疊成發(fā)夾結構或二聚體，從而影響引物與模板的復性結合。

四、引物5'端可以修飾，3'端不可修飾

1引物的5' 端決定著(zhù)PCR產(chǎn)物的長(cháng)度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，加標記熒光，引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。

2引物的延伸是從3'端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。

3在引物的5`端連接一對限制酶的識別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。

五、退火溫度要適宜

退火溫度高，擴增特異性強；退火溫度低，擴增效率高。

原因：如果引物堿基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數較多，那么可以適當減低退火溫度，使DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(huì )影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的。

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