細胞免疫熒光實(shí)驗的方法、步驟有哪些？

細胞免疫熒光主要應用于細胞內抗原抗體檢測，適用于細胞水平實(shí)驗。那么細胞免疫熒光有哪些方法和步驟呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、直接法

將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色，用水洗去未參加反應的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片、鏡檢。

二、間接法（較為常用）

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進(jìn)行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

三、操作步驟

1.倒出培養液。

2.潤洗，將1ml SDwan全培養基沿培養板緩慢打入，蓋上蓋子，輕柔搖晃，先使用1ml的槍沿側壁吸出潤洗后，再使用200ul的槍沿壁吸出殘液。

3.吹打，加入2ml SDwan全培養基，打在培養板底部，然后反復抽打，直至培養板底部由磨玻璃樣變?yōu)橥该?。（吹打之后放置，后使用之前都要反復吹打?/p>

4.將細胞爬片放入24孔板，每孔一個(gè)（注意每個(gè)孔只放一個(gè)，不要多放，注意檢查）。

5.往（3）中吹打后的細胞液中繼續加4ml的SDwan全培養基（即總計6ml）。將細胞液分裝到24孔板中（分裝之前吹打，防止細胞沉降而造成的不均勻），每個(gè)板500ul。注意事項：每一步打開(kāi)細胞培養時(shí)，防止細胞培養板蓋時(shí)勿使細胞培養板蓋朝上放置。

6.在將細胞培養板放于培養箱之前，請噴酒精。

7.細胞培養24小時(shí)之內使用，最好20小時(shí)。沿側壁吸出培養液。1PBS潤洗2次，沿側壁打入1ml或500ul PBS，輕柔搖勻2-3次后，沿側壁吸出。

8.Pfu number/細胞數=pfuV/細胞數=感染復數 感染復數為2，加病毒20ul + 480ul SD培養液 感染復數為15，加病毒150ul + 480ul SD培養液 病毒滴數經(jīng)提前測定為1*10-7pfu/ml

9.先加SD培養基再加病毒。（24h或48h之后進(jìn)行（10））

10固定細胞：吸出上清，加4%PFA（組織固定液），1ml/孔，室溫下30min。

11.PBS洗2次，5min/次，1ml/孔。

12.細胞破膜：0.1% Triton in PBS(PBST,T為T(mén)riton) ，PBS：Triton=1L：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室溫1h。

13.封閉：5% BSA in PBST（T:0.5%Tween）=BSA + PBST (100ml PBST 中添加5g BSA ) PBST=PBS+Tween(1L PBS中添加500ulTween)  BSA 為牛血清白蛋白。1ml/孔，室溫下2h。

14.一抗：用封閉液按1：100（比例依照抗體說(shuō)明書(shū)）稀釋?zhuān)?00ul/孔，4攝氏度過(guò)夜。

15.PBST（Tween）洗3次，10min/次 。

16.二抗（4℃抗體熒光抗體）：用PBST（Tween）按1：1000稀釋?zhuān)?00ul/孔，室溫避光1h。

17.PBST（Tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） DPAI ，300ul/孔，室溫避光10分鐘。

18.PBS 洗2次，1ml/孔，立馬抽出。

19.載玻片上滴加封片液，細胞爬片的細胞層與封片液接觸。

20.熒光共聚焦顯微鏡觀(guān)察。

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