你知道WB實(shí)驗操作步驟有哪幾步嗎？

蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)：又稱(chēng)為免疫印跡，根據抗原抗體的特異性結合，半定量檢測樣品中的某種蛋白的方法?；驹硎峭ㄟ^(guò)特異性抗體對凝膠電泳處理過(guò)的細胞或生物組織樣品進(jìn)行著(zhù)色。通過(guò)分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況。那么你知道WB實(shí)驗操作步驟有哪幾步嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、樣本制備蛋白提取

1.前期準備：首先要了解你所研究蛋白的內源表達水平，常用的數據庫如Uniport、Atlas、BioGPS，或查閱相關(guān)文獻。設置陽(yáng)性對照，選擇內參蛋白。

2.蛋白提?。菏荳estern Blotting 的第一步，要求選擇樣本新鮮，降低背景，避免反復凍融，選擇合適的裂解液裂解樣本，選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑，防止蛋白的降解和磷酸化信號的丟失。

二、蛋白濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定的方法包括Lowry法、Bradford法、BCA法，常用的是BCA法，基本原理是在堿性條件下，蛋白將Cu+ +還原為Cu+，Cu+ 與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò )合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線(xiàn)對比，即可計算待測蛋白的濃度。

之后加入Loading buffer，含有變性劑，使蛋白質(zhì)變性，釋放二硫鍵，最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。

三、上樣和電泳

1. 制備凝膠：根據蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，配膠的APS需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中，APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。

2.上樣：蛋白Marker孔加入5-10μL，多選擇生物素化蛋白Marker，其余蛋白總上樣量20-50μg，組織樣本稍多些上樣，盡量保持每個(gè)泳道的上樣量一致，空泳道用Loading buffer補齊。

3. 電泳：接上電源后，先用80V恒壓電泳濃縮至溴酚藍指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線(xiàn)狀，改為恒壓100v--120v直至溴酚藍電泳到凝膠底部，此過(guò)程約用時(shí)1.5h。

四、轉膜

1.膜的選擇：廣泛使用的是NC膜和PVDF膜

2.轉膜：轉膜的方法包括濕轉、半干轉、干轉，濕轉是轉膜最完quan且應用zui廣泛的方法，但是所需時(shí)間較長(cháng)。

五、封閉和抗體孵育

1.封閉：目的是為了減少膜對一二抗的非特異吸附，降低背景。將NC膜從濕轉系統中取出，并用TBST潤洗2次，每次5 min，然后進(jìn)行封閉。

化學(xué)發(fā)光法：用含5% 脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡NC膜，室溫搖床封閉1-2h；

熒光法：含5% 脫脂奶粉的TBS，脫脂奶粉需選擇實(shí)驗室級別的。

最后再用TBST潤洗封閉后的NC膜3次，每次5 min。

2.抗體孵育：一抗能識別膜上不同種屬的蛋白，買(mǎi)經(jīng)過(guò)驗證的，二抗上帶有發(fā)光底物，只能識別一抗。

六、顯色曝光

常用的是化學(xué)發(fā)光，抗體上偶聯(lián)的HRP催化ECL發(fā)光底物顯色，取出洗滌的膜后，用濾紙吸干水分，放置于成像儀上，均勻滴加ECL工作液，排出氣泡，開(kāi)始曝光。

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