流式細胞儀的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？

流式細胞儀(flow cytometry，FCM)作為一種強大的單細胞分析工具，可以對于處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的細胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。那么流式細胞儀的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )影響檢測結果嗎？

通常情況下，標記細胞表面抗原的熒光抗體需要在室溫孵育20-30分鐘。

對于一些狀態(tài)較脆弱的細胞（例如從組織中分離、培養的免疫細胞），切勿過(guò)長(cháng)時(shí)間孵育，同時(shí)建議使用染色緩沖液（Staining Buffer），其中主要成分為PBS，疊氮鈉和胎牛血清，胎牛血清可以減少抗體的非特異性結合，疊氮鈉可以維持細胞表面抗原的穩定性。

對于胞內或者核內標記抗體，可以在固定、破膜后適當延長(cháng)孵育時(shí)間，或者破核膜同時(shí)孵育核內抗體。

二、樣本不能及時(shí)上機檢測，血樣和組織樣本的保存方法？

通常情況下建議樣本處理至表面抗體孵育結束，再用1%多聚甲醛重懸固定4℃保存至下一步，或者4%多聚甲醛固定10分鐘后洗去，用StainingBuffer重懸，4℃保存至下一步，48小時(shí)內上機檢測。如不具備前處理條件，外周血可以使用流式專(zhuān)用保存管存放，組織樣本剪成小塊后用保存液存放，建議不錯過(guò)3天進(jìn)行前處理和上機檢測。

三、流式細胞儀測細胞周期，各個(gè)周期峰分不開(kāi)，只有一個(gè)寬峰是為什么？

①如果是持續出現這種情況，說(shuō)明儀器的PI檢測通道CV值過(guò)高，管路需要深度清潔或者更換。

②前處理過(guò)程中出現的問(wèn)題，如：乙醇固定條件（濃度、時(shí)間）的改變造成通透不wan全、RNA沒(méi)有處理wan全、通道CV較差同時(shí)受到異倍體干擾等。

③如果個(gè)別組出現此情況，可能是受到實(shí)驗處理條件的影響，如：轉染的熒光干擾、集中在周期區間的抑制、對細胞影響過(guò)大等。

四、鈣離子（Ca2+）流式檢測如何設置對照？

Ca2+檢測通常使用Fluo-3、Fluo-4等熒光探針，這類(lèi)探針通常會(huì )在活細胞內與鈣離子結合發(fā)出熒光，進(jìn)行相關(guān)成像或流式檢測。因此鈣離子檢測會(huì )有靜態(tài)檢測和動(dòng)態(tài)檢測兩種方法。

靜態(tài)檢測主要用于檢測相對胞內濃度變化，需要設置空白對照、陰性對照、陽(yáng)性對照，以相對的方式檢測熒光值。

動(dòng)態(tài)檢測主要用于檢測鈣動(dòng)員的情況，監測加入刺激劑后的Ca2+變化情況。通常用于檢測一些免疫細胞，也可以用于分析不同淋巴細胞亞群的變化情況。

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