免疫細胞（ICC）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？

免疫細胞化學(xué) (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來(lái)檢測細胞內靶抗原的技術(shù)。那么免疫細胞（ICC）實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、熒光信號弱

1. 樣品質(zhì)量

選用新鮮制備的樣本以及適當的保持條件。

2. 靶標豐度低

適當提高一抗濃度。

選擇熒光強度更強的二抗。

3. 固定方法不當

甲醛和蛋白的氨基通過(guò)共價(jià)鍵結合，可能會(huì )遮蓋抗原表位，導致靶表位信號減弱。建議調整抗原修復方法或固定方法。

多聚甲醛會(huì )與GFP熒光蛋白發(fā)生醛化反應，導致信號減弱。

檢測膜蛋白一般不建議使用甲醇或丙酮固定，有機溶劑能夠破壞膜結構。

4. 透化方法不當

檢查靶標蛋白表達位置，胞內蛋白需要透化處理。

膜蛋白需要考慮所檢測靶表位位于膜內還是膜外，膜外則不需要透化。

5. 信號放大不夠

如果檢測靶點(diǎn)是低豐度蛋白．信號弱可能是由于信號放大不足導致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信號放大技術(shù)，進(jìn)一步增強信號，實(shí)現低豐度，難以檢測蛋白的檢測。

二、背景太高

1. 封閉不足

（1）選用二抗種屬來(lái)源的血清封閉。

（2）選用鏈霉親和素/生物素系統，需要用鏈霉親和素封閉內源的生物鏈酶。

（3）選用HRP系統，需要使用過(guò)氧化氫等商業(yè)化試劑盒去活化內源性HRP。

（4）選用AP系統，需要使用左旋咪唑等商業(yè)化試劑去活化內源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗濃度過(guò)高，減少用量

3. 二抗

（1）設置無(wú)一抗對照，幫助確認背景是否來(lái)源二抗。

（2）二抗濃度過(guò)高，減少用量。

（3）抗體凝聚，使用二抗前離心去掉抗體凝聚物。

（4）使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自發(fā)熒光

（1）設置自發(fā)熒光對照，確定是否自發(fā)熒光。

（2）固定劑如醛類(lèi)和氨基共價(jià)結合導致的自發(fā)熒光，可用硼氫化na去除。

（3）增加固定劑的漂洗次數。

（4）避開(kāi)背景高的波段，選用背景較低的波段檢測。

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