MLPA技術(shù),即多重連接探針擴(kuò)增技術(shù),于2002年首先報(bào)道,是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異,在一次反應(yīng)中可以檢測45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變,已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究。下面讓我們一起來看看MLPA技術(shù)的試驗(yàn)原理吧!
在MLPA實(shí)驗(yàn)中,純化的樣本DNA被變性。之后用MLPA探針寡核苷酸孵育過夜。每個(gè)MLPA探針都具有針對特定基因組序列的探針。每對MLPA探針包括兩條單鏈DNA:左側(cè)探針和右側(cè)探針寡核苷酸。簡稱分別是LPO和RPO。LPO和RPO包含PCR引物和DNA雜交序列。
在MLPA反應(yīng)中,左探針寡核苷酸(LPO)和右探針寡核苷酸(RPO)都與靶序列進(jìn)行雜交,之后使用連接酶連接兩部分探針。
將雜交的探針寡核苷酸連接到鄰近的目標(biāo)序列。探針連接產(chǎn)物的數(shù)量是樣品中目標(biāo)序列數(shù)量的度量。連接反應(yīng)具有高度特異性,連接部位周圍沒有錯(cuò)配。
使用單個(gè)通用引物對在多重PCR中擴(kuò)增連接的探針。只有連接的探針呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,使得不需要去除未連接和未連接的探針。
再通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分離,通過MRC Holland的分析軟件進(jìn)行分析得出結(jié)論。PCR產(chǎn)物裝載到毛細(xì)管電置上,按長度分離。每個(gè)片段對應(yīng)一個(gè)特定的MLPA探針。
MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù),不僅可以用來檢測與疾病相關(guān)的CNV(?拷貝數(shù)變異)?,?例如遺傳性乳腺癌、?結(jié)腸癌、?杜氏肌營養(yǎng)不良等,?還可以用于腫瘤中的CNV檢測,?以優(yōu)化腫瘤分型。任何技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)。
優(yōu)點(diǎn):
1、高效:一次反應(yīng)可以檢測45個(gè)靶序列拷貝數(shù)的改變。
2、特異:可以檢測點(diǎn)突變。
3、快速:一次實(shí)驗(yàn)可以在24小時(shí)內(nèi)完成。
4、簡便:不同的試劑盒操作基本相同,容易掌握。
缺點(diǎn):
1、需要精確測量DNA的濃度,樣本容易被污染。
2、不能用于單個(gè)細(xì)胞的檢測。
3、MLPA用于檢測基因的缺失或重復(fù),不適合檢測未知的點(diǎn)突變類型。
4、不能檢測染色體的平衡易位。