在上篇MLPA試驗(yàn)原理中,我們已經(jīng)詳細(xì)介紹了MLPA技術(shù)。MLPA,即多重連接探針擴(kuò)增技術(shù),是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測基因的拷貝數(shù)變異和序列變異。它結(jié)合了PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和連接酶技術(shù),通過設(shè)計(jì)特定的探針來識(shí)別和擴(kuò)增目標(biāo)DNA序列。下面讓我們一起來看看MLPA的試驗(yàn)步驟吧!
MLPA試驗(yàn)步驟分為六步:變性、雜交、連接、PCR擴(kuò)增、片段分離、數(shù)據(jù)分析。
一、變性
將DNA標(biāo)本放入PCR儀中加熱5分鐘,使DNA雙鏈解鏈成單鏈。純化的樣本DNA被變性。
二、雜交
加入雜交反應(yīng)液。雜交反應(yīng)液包含SALSA MLPA探針混合液和SALSA MLPA緩沖液。每組MLPA探針混合物包含多達(dá)60對不同的MLPA探針,每個(gè)探針識(shí)別一個(gè)特異的靶序列。MLPA探針由兩部分組成:左探針和右探針寡核苷酸(LPO和RPO)。LPO和RPO包含PCR引物和DNA雜交序列。在MLPA反應(yīng)中,左探針寡核苷酸(LPO)和右探針寡核苷酸(RPO)都與靶序列進(jìn)行雜交。
三、連接
實(shí)驗(yàn)第二天,加入連接酶反應(yīng)液。反應(yīng)液包括連接酶緩沖液A,連接酶緩沖液B和SALSA連接酶Ligase-65。連接酶Ligase-65結(jié)合到與靶序列雜交的左側(cè)探針和右側(cè)探針上,催化產(chǎn)生一個(gè)共價(jià)鍵。隨后,通過加熱反應(yīng)液使連接酶失活,從而終止連接步驟。連接酶Ligase-65特異性非常高,只要雜交區(qū)域有一個(gè)核苷酸錯(cuò)配,連接酶就不會(huì)連接兩段探針,使連接反應(yīng)具有高度特異性。正是由于這種高特異性,MLPA也可以用于區(qū)分序列高度相似的假基因,以及檢測特定的點(diǎn)突變。
四、PCR擴(kuò)增
加入PCR聚合酶混合液。PCR聚合酶混合液包含SALSA PCR聚合酶及SALSA PCR引物混合液。PCR引物混合液中包含dNTPs、正向引物和反向引物。正向PCR引物帶有熒光標(biāo)記。所有連接上的MLPA探針均使用這對PCR引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)包含變性、引物復(fù)性以及引物延伸,循環(huán)35次。熒光標(biāo)記被帶入到MLPA擴(kuò)增產(chǎn)物,即MLPA擴(kuò)增子中。
五、片段分離
擴(kuò)增后,用毛細(xì)管電泳分離片段。毛細(xì)管電泳根據(jù)片段的長度進(jìn)行分離,并將不同長度的片段顯示為峰值模式,稱為電泳圖。
六、數(shù)據(jù)分析
每個(gè)探針上的填充序列不同,每個(gè)擴(kuò)增子都有不同的已知大小,因此在數(shù)據(jù)分析過程中可以對每個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行量化。毛細(xì)管電泳得到的數(shù)據(jù)將作為分析的輸入,輸入數(shù)據(jù)分析軟件Coffalyser。通過將每個(gè)樣本與一組參考樣本進(jìn)行比較,我們可以得到一個(gè)探針比,這個(gè)探針比率將告訴我們一個(gè)基因有多少個(gè)拷貝數(shù)。由于大多數(shù)人類基因是二倍體,如果樣本有兩個(gè)拷貝,比例將為1.0,即樣本探針獲得的基因數(shù)量與參考樣本相同。如果比值為0.5,則該基因在個(gè)體中只有一個(gè)拷貝,這可能意味著目標(biāo)基因的雜合缺失。另一方面,如果這個(gè)比率是1.5,那么很可能存在一個(gè)基因的雜合復(fù)制。