PCR引物設計的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些？

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特異性反應的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設計。那么你知道PCR引物設計的關(guān)鍵點(diǎn)有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、引物最好在模板cDNA 的保守區內設計

DNA序列的保守區是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。

二、引物長(cháng)度一般在15~30 堿基之間

引物長(cháng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過(guò)長(cháng)會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應。

三、引物GC 含量在40%~60%之間，Tm 值最好接近72℃

GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

四、引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3 位

如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì )影響擴增的特異性與效率。

五、引物3′端不能選擇A，最好選擇T

引物3′端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著(zhù)很大的差異，當末位的堿基為A 時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T(mén) 時(shí)，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯配的引發(fā)效率介于A(yíng)、T 之間，所以3′端最好選擇T。

六、引物應具有特異性

引物設計完成以后，應對其進(jìn)行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗了。

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